Cultivado, impreso y biológicamente aumentado: Un aditivo fabricado microfluídico usable, plantilla funcional para microbios sintéticos

Resumen

A pesar de los avances significativos en biología sintética a escala industrial, los desafíos de fabricación digital tienen, hasta la fecha, impidió su implementación a escala de producto. Presentamos, Mushtari, un fluido multimaterial impreso en 3D portátil diseñado para cultivar comunidades microbianas. De este modo, introducimos un entorno de diseño computacional para la fabricación aditiva de canales fluídicos geométricamente complejos y materialmente heterogéneos. Nosotros demostrar cómo se puede controlar la variación controlada de las propiedades geométricas y ópticas a alta resolución espacial logrado a través de una combinación de modelos de crecimiento computacional e impresión de mapas de bits multimateriales. Además, presentamos la implementación, caracterización y evaluación de métodos de soporte para crear fluidos a escala de producto. Finalmente, exploramos la citotoxicidad de los materiales impresos en 3D en estudios de cultivo con el microorganismos modelo, Escherichia coli y Bacillus subtilis. Los resultados apuntan hacia posibilidades de diseño que se encuentran en la intersección del diseño computacional, la fabricación aditiva y la biología sintética, con lo último objetivo de impartir funcionalidad biológica a productos impresos en 3D.

Introducción

Visión

¿Cómo podemos diseñar relaciones entre las formas de vida más primitivas y más sofisticadas? ¿Podemos diseñar wearables incrustados con microorganismos sintéticos que mejoren y aumentar la funcionalidad biológica? Exploramos estas preguntas a través de la creación de Mushtari (Fig. 1), un Impreso 3D ponible que comprendía 58 metros de canales internos de fluido. La pieza conceptual portátil se diseñó para funcionar como una “fábrica de microbios” que utiliza genéticamente modificados
microbios para hacer productos útiles para el usuario.

De manera óptima, Mushtari podría habilitar e informar una relación simbiótica entre dos microorganismos: autótrofos fotosintéticos, como microalgas o cianobacterias, y compatibles. heterótrofos, como Escherichia coli o Bacillus subtilis. Los microbios fotosintéticos podrían convertir la luz solar en nutrientes, para los heterótrofos, que a su vez podrían producir compuestos para aplicaciones específicas. Esta forma de simbiosis microbiana, un fenómeno que se encuentra comúnmente en la naturaleza, 1 se basa en la simbiosis herent presente entre el usuario y los microbios dentro del dispositivo portátil. Basado en la biocompatibilidad demostrada para microbios que se muestra en las pruebas de citotoxicidad de los materiales impresos en 3D utilizados en este estudio, en última instancia, imaginamos un prototipo fotosintético completamente funcional que contiene heterótrofos diseñados para que el usuario pueda desencadenar
Producción microbiana de compuestos específicos de interés, incluyendo aromas, 2 pigmentos, 3 y combustibles 4.

Si bien la impresión 3D se ha demostrado previamente como un medio viable para la producción de productos a escala portátiles, esta tecnología no se ha utilizado previamente para imprimir un dispositivo portátil con una red fluídica interna. Hasta hace poco, la fabricación aditiva se había utilizado para producir dispositivos microfluídicos, 6 pero solo en un solo material y / o típicamente a pequeña escala, generalmente por debajo de los tamaños de característica de 10 cm, cuando en comparación con la escala de un dispositivo portátil típico. Mushtari es el primer dispositivo fluídico de su clase con canales de hasta 1 mm de diámetro. Fue fabricado digitalmente a escala portátil y examina la ecología del material 7 dentro de un dispositivo portátil impreso en 3D que incorpora comunidades microbianas funcionales.

HIGO. 1. Vista lateral de Mushtari. El dispositivo portátil impreso en 3D combina una red interna continua de canales fluídicos biocompatibles con transparencia óptica variable mediante el uso de fabricación de aditivos multimateriales basados en mapas de bits. Mushtari se produjo en colaboración con Stratasys Ltd. en una impresora 3D Multimaterial Objet 500 Connex 3. Foto: Yoram Reshef, cortesía del Mediated Matter Group. Imágenes en color disponibles en línea en http://www.liebertpub.com/3dp

Acercarse

La creación de plantillas funcionales 8 de la actividad microbiana a través de la impresión 3D de distribuciones heterogéneas de material, o la capacidad de diseñar un sistema de material de arriba hacia abajo que pueda informar procesos biológicos de abajo hacia arriba (como guiar el crecimiento microbiano con el propósito de la fotosíntesis), es un concepto fundamental para El diseño de usables biológicamente aumentados. Nuestro enfoque para diseñar Mushtari se centra en los métodos mediante los cuales la impresión 3D multimaterial heterogénea para el diseño de materiales intermedios personalizados, en combinación con nuevas estrategias de fabricación aditiva, se puede utilizar para la fabricación de canales fluídicos complejos que crean un hábitat artificial para el crecimiento microbiano.

Organización

El artículo está organizado en tres secciones: (1) Cultivo de Mushtari, (2) impresión de Mushtari, y (3) Aumentado Mushtari. En la primera sección, mostramos cómo se generaron las geometrías complejas de los canales y cómo se modelaron las distribuciones heterogéneas de materiales dentro de estos canales. En la segunda sección, presentamos un método de fabricación digital para controlar la distribución de material mediante la impresión 3D multimaterial, utilizando un nuevo material de soporte líquido, que permite la fabricación de una vasta red interconectada de canales internos. Finalmente, en la tercera sección, demostramos la biocompatibilidad de los materiales impresos en 3D en el contexto de los estudios de crecimiento microbiano. Las tres secciones mencionadas anteriormente se relacionan con sus respectivos dominios de conocimiento (diseño computacional, fabricación aditiva y biología sintética) que se fusionan con una implementación de biología sintética, primera en su tipo, en el dominio de la impresión 3D, y viceversa.

Cultivo de Mushtari

La motivación del diseño detrás de Mushtari fue crear un dispositivo portátil a gran escala con canales fluídicos que circunnavegan el cuerpo humano de una manera densa y llena de espacio. Para lograr esto, el diseño implicó un proceso computacional que emula el crecimiento natural de manera controlada. Esto, a su vez, condujo al desarrollo de estructuras similares a las naturales y orgánicas, que culminaron en un diseño de “simbiosis” entre el crecimiento artificial (computacional) del ambiente contenedor y el crecimiento natural (biológico) de los microorganismos contenidos. Como tal, Mushtari fue diseñado usando un algoritmo de crecimiento generativo, que emula el crecimiento biológico mediante el desarrollo de geometrías complejas en múltiples iteraciones. Procesos similares incluyen, por ejemplo, Lindenmayer-Systems9 (L-Systems), que es una gramática formal ampliamente utilizada, donde las reglas se aplican en paralelo para generar estructuras de ramificación. Las ecuaciones de reacción-difusión proporcionan otro ejemplo, donde se implementan ecuaciones diferenciales parciales para modelar la distribución de componentes dentro de una reacción, imitando fenómenos de formaciones de patrones que se caracterizan por la variación de propiedades utilizando múltiples especies (por ejemplo, materiales) .10 Más recientemente,
Se ha propuesto el uso de un sistema de masa-resorte simplificado sobre una malla con una estrategia de refinamiento selectivo para la generación de formas celulares.11

Implementando un sistema similar, nuestro enfoque nos permite informar la geometría global o general, la geometría de malla local, así como las variaciones en la distribución de las propiedades del material a través de escalas de longitud, al alterar la fuerza relativa de relajación, atracción y repulsión a lo largo de varias iteraciones. descrito abajo. Este enfoque permitió el diseño de un solo canal que “crece” en numerosas iteraciones para generar un dispositivo portátil con 58 metros de estructura interna hueca. El canal utiliza variaciones en el diámetro, de 1 a 25 mm, como se muestra en la Figura 2, así como variaciones en la transparencia; calificado localmente dentro del dispositivo portátil para crear áreas donde los microbios fotosintéticos puedan recibir luz, prosperar y crecer.

FIG. 2. Visualización de 100 pasos de iteración a partir de tres variaciones de crecimiento diferentes que se utilizan para generar el fluido usable, Mushtari (orientaciones izquierda, media y derecha, en cada panel). Se muestran los controles a escala global y local sobre la generación de los canales fluídicos, así como la capacidad de sintonizar las propiedades del material durante el crecimiento computacional. Los materiales que se muestran en rojo representan áreas transparentes, mientras que los materiales que se muestran en blanco representan áreas opacas. El enfoque más a la izquierda (en cada panel) varía la transparencia como una función periódica de la longitud del hilo. El enfoque central varía la transparencia según el diámetro del tubo. En el enfoque más a la derecha, las propiedades del material se asignan por regiones. Imágenes en color disponibles en línea en http://www.liebertpub.com/3dp

Marco general

El marco general que impulsa la generación de Mushtari se muestra en la Figura 3. Una representación de entrada geométrica (por ejemplo, una malla triangular, un conjunto de segmentos de línea o una nube de puntos) se transforma primero en una representación intermedia. A partir de esta representación intermedia, se genera una representación implícita gruesa. La información de estas tres representaciones se usa para deformar la representación geométrica inicial. Finalmente, la representación inicial deformada se modifica topológicamente para reaccionar a la deformación del objeto. Esto se hace de forma iterativa, de modo que una representación de entrada dada se deforma y refina continuamente. A medida que el proceso se repite, las deformaciones se agregan en el crecimiento de una forma coherente. Para una presentación exhaustiva que muestra 15 derivaciones diferentes de este proceso, nos referimos a un estudio de Bader y Kolb.12

HIGO. 3. Resumen esquemático del marco general utilizado para la generación de estructuras desarrolladas computacionalmente.

Crecimiento de líneas poligonales.

La figura 4a muestra cómo se puede adaptar el marco general para animar el crecimiento de una línea poligonal que actúa como columna vertebral para el canal de fluido del dispositivo portátil. En este caso, la representación de entrada es una línea poligonal, mientras que la representación intermedia es una nube de puntos. La representación implícita es un campo de distancia, 13 dado por las distancias a los puntos de la representación intermedia y los radios asociados. La deformación se describe mediante un desplazamiento de los vértices de la línea poligonal. La transformación topológica posterior se realiza mediante remuestreo de la línea. La naturaleza iterativa de este proceso da como resultado una deformación continua de la línea poligonal de entrada.

FIG. 4. (a) Ejemplo del marco general aplicado a una línea poligonal. (b) varias iteraciones de este proceso en última instancia resultando en una arquitectura compacta en espiral. En esta figura, el proceso está restringido al espacio tangente de un subyacente malla triangular guía (no se muestra). Imágenes en color disponibles en línea en http://www.liebertpub.com/3dp

Plantillas funcionales

La motivación principal asociada con el aumento biológico del dispositivo fue contener un cocultivo sostenible de microbios fotosintéticos que capturan la energía solar y nutren otras comunidades microbianas heterotróficas. El diseño requería e involucraba plantillas funcionales, 8 logradas a través de la capacidad de ajuste de alta resolución de las propiedades del material, como la opacidad. Los canales transparentes o translúcidos permitirían la exposición de los fotótrofos a la luz solar y la posterior transferencia de energía química en forma de carbono fijo a bacterias heterotróficas como B. subtilis y E. coli. Por lo tanto, nuestro enfoque de diseño requería la parametrización de las propiedades del material para la plantilla funcional. Este enfoque se presenta en la Figura 5.

FIG. 5. (a) El efecto deseado de la transparencia del material sobre la actividad microbiana. En regiones translúcidas, la cocultura recibe luz, aumentando la actividad fototrófica (columna derecha). En regiones opacas, el cocultivo es oscuro y los heterótrofos consumen los fotosinatos, aumentando así su actividad metabólica. La transparencia se puede controlar globalmente, como se muestra en la columna media superior, independientemente de la hebra, o localmente, se muestra en la columna media inferior, utilizando la longitud de la ruta parametrización como guía para distribuciones de materiales. (b) Implementación del enfoque global de modelado heterogéneo en el ponible. (c) Visualización del capítulo desplegado que muestra cómo el enfoque basado en la fuente general (“global”) influye en los cambios locales en la opacidad a lo largo del hilo Figura 6. Imágenes en color disponibles en línea en http://www.liebertpub.com/3dp

Para permitir la creación de plantillas funcionales a través del control continuo sobre regiones transparentes y opacas, utilizamos técnicas de modelado de materiales heterogéneos.14 Las propiedades del material se especificaron como una función de la longitud del camino de la hebra cultivada, o se definieron globalmente al especificar fuentes externas.15 Mientras se parametrizó el enfoque permite un mejor control sobre la variación local, el enfoque global produce un mejor control de la distribución general del material (este último se eligió para Mushtari, como se muestra en la Figura 5b). La Figura 5c muestra el canal de fluido generado en su estado desplegado, ilustrando las distribuciones locales de material requeridas para lograr la distribución global en la forma plegada final. Las distribuciones de materiales modeladas se fabricaron posteriormente utilizando una impresora 3D multimaterial Objet 500 Connex 3 (Stratasys Ltd.) utilizando VeroClear transparente
(RGD810) y materiales rígidos y opacos VeroRed.16

Imprensión Mushtari

Impresión 3D de un tracto materialmente heterogéneo

Para modelar eficazmente la contención y la actividad de los medios fluidos dentro del dispositivo portátil, es necesario fabricar digitalmente canales que sean geométricamente complejos, así como material y ópticamente heterogéneos. La producción de un conducto único ópticamente heterogéneo plantea desafíos técnicos significativos desde una perspectiva de fabricación aditiva. Específicamente, para fabricar un solo canal con propiedades variables, el uso de ensambles multipartes con propiedades predefinidas y consistentes, o, de manera similar, el uso de insertos de tubo después de la fabricación se consideró poco práctico. Como tal, para fabricar un tracto continuo que es a la vez materialmente heterogéneo y hueco, utilizamos un enfoque de impresión de mapa de bits para crear gradientes de opacidad controlables y aprovechamos una nueva estrategia de material de soporte líquido que permite la fabricación de vastas redes de canales.

Impresión voxel multimaterial de canales fluídicos

Para imprimir en 3D canales materialmente heterogéneos, implementamos una técnica de impresión 3D basada en vóxel, 17 que permitió la fabricación digital de gradientes de propiedades de materiales. Las modernas impresoras 3D multimateriales 18 utilizan un enfoque de impresión similar al chorro de tinta para construir piezas mediante el depósito de gotas de resina fotopolimérica curables por UV de una capa por capa. Al depositar gotas de material distintas de resinas base en alta resolución (600 ppp en xy 300 ppp en y), las gotas de material cercanas se difundirán a un nivel de micras, lo que dará como resultado la formación de materiales híbridos con propiedades intermedias. El control de esta ubicación de alta resolución permite la creación de materiales graduados funcionalmente a una escala fina. Para lograr este nivel de control, implementamos un método personalizado de corte en 3D y distribución de materiales, 19 que permite la utilización de fuentes de datos externas para evaluar métodos de modelado de materiales heterogéneos durante el corte y como tal, permite el cálculo de distribuciones de materiales en Alta resolución espacial. Estas descripciones de modelado de materiales se utilizan para generar matrices voxel 3D binarias que contienen descripciones de deposición espacial de gotas para la impresora 3D. Dado que la impresora 3D utilizada en este estudio puede imprimir tres materiales diferentes simultáneamente (o cuatro, incluido el material de soporte), es posible generar de tres a cuatro matrices 3D con la resolución nativa de la impresora. Estas descripciones de depósito de material se pueden utilizar para lograr materiales altamente precisos funcionalmente clasificados (Fig. 6). En este estudio, las proporciones de gotitas de material depositado proximalmente local dictan las propiedades funcionales de los materiales compuestos impresos. Como se muestra en la Figura 6a, al variar continuamente la proporción de gotas de material opaco (VeroRed) a transparente (VeroClear), podemos lograr un alto control sobre los gradientes de opacidad en la parte impresa en 3D, como se muestra en la Figura 6b, lo que efectivamente nos permite implementar plantilla funcional deseada.

FIG. 6 las áreas donde se modelan los gradientes ópticos (abajo). (b) Gradientes ópticos reales fabricados con canales internos llenos. (c) Canales huecos llenos de líquido quimioluminiscente con fines de visualización. Imágenes en color disponibles en línea en http://www.liebertpub.com/3dp

Además, este enfoque nos permite utilizar operaciones booleanas de alta resolución y alta precisión sin modificar la geometría real. Logramos esto al especificar el uso de material de soporte sobre los materiales del modelo en áreas que se desean que sean huecas en la forma final. Esto nos permite crear canales físicamente huecos, después del proceso de limpieza, en geometrías complejas arbitrarias sin modificar la descripción de la forma real como se muestra en la Figura 6c.

Si bien los materiales VeroClear son intrínsecamente transparentes, la deposición de material de soporte durante el proceso de impresión da como resultado un endurecimiento parcial de VeroClear después de la extracción del material de soporte, con la parte resultante exhibiendo una claridad óptica parcialmente disminuida. Si bien esta pequeña reducción en la claridad óptica fue adecuada para nuestra aplicación específica, se puede lograr una mayor claridad óptica puliendo y lacando la parte impresa en 3D para reducir esta rugosidad superficial intrínseca.

Si bien el volumen de construcción de la impresora 3D utilizada en este estudio mide 50 · 40 · 20 cm, para lograr un objeto de escala portátil, dividimos el formulario en un conjunto de cinco piezas para que cada pieza pueda caber en el volumen de construcción del impresora. Cada pieza presentaba un solo canal largo y los cinco canales combinados se extendían 58 metros en total con diámetros que iban de 1 a 25 mm.

Imprimir un canal hueco

Las impresoras 3D multimateriales 18 utilizan un material de soporte separado para permitir la impresión de geometrías complejas con voladizos o estructuras internas. Durante el proceso de impresión, este material de soporte tipo gel (SUP705) se agrega a cualquier estructura interna, incluida la red de canales fluídicos. Una vez que se completa el proceso de impresión, el material de soporte similar al gel se elimina abrasivamente usando un chorro de agua a alta presión que debe entrar en contacto directo con el material de soporte. Este proceso funciona bien para geometrías voluminosas grandes o para aquellas con huecos internos cortos, pero no es adecuado para canales fluídicos largos debido al acceso restringido al canal. Para superar esta barrera, investigamos el uso de dos métodos de soporte alternativos; un soporte soluble disponible (SUP707) y un soporte líquido desarrollado experimentalmente. El material de soporte soluble es un material polimérico que se disuelve en agua y puede sustituirse por el soporte de gel típico en el flujo de trabajo de impresión 3D normal. El método de soporte líquido utiliza un material con propiedades de material prepolimérico similares pero que no puede polimerizarse con luz UV. Este soporte líquido puede imprimirse en canales internos mediante la asignación de una malla STL o una matriz de vóxel 3D separada de la geometría del canal interno al material de soporte líquido.

Caracterización y evaluación de métodos de apoyo.

El soporte soluble y el soporte líquido presentan dos opciones potenciales para crear canales fluídicos internos dentro del dispositivo portátil. Para evaluar los dos métodos de soporte, diseñamos piezas de prueba que contenían canales de 1 a 20 mm de diámetro, como se muestra en la Figura 7 (columna más a la derecha). Imprimimos la pieza de prueba usando soporte normal (SUP 705), soporte soluble (SUP707) y soporte líquido. Se examinaron secciones transversales de piezas de prueba usando microscopía óptica. Las imágenes se obtuvieron utilizando un endoscopio digital USB Vividia 2.0 MP de mano, como se muestra en la Figura 7. Las piezas de prueba impresas con soporte líquido en una orientación horizontal fueron las únicas piezas de prueba que podían liberarse por completo del soporte y el líquido podía pasar fácilmente a través de todos los canales. (A – G) para cada una de las tres réplicas de muestra. En las piezas de prueba impresas con soporte soluble y líquido en una orientación vertical, los canales mayores o iguales a 1 mm de diámetro (B – G) podrían despejarse. En las piezas de prueba impresas con el soporte de gel tradicional, solo se pueden eliminar los canales mayores o iguales a 3 mm (E – G). Se midieron tres réplicas para cada tipo de soporte y se realizaron tres réplicas técnicas para cada medición. La Tabla 1 resume las dimensiones esperadas y medidas de las secciones transversales de la pieza de prueba.

Para probar la idoneidad de cada material de soporte para los canales fluídicos internos complejos del dispositivo portátil, diseñamos una segunda pieza de prueba como se muestra en la Figura 8 para reflejar la geometría del dispositivo portátil final. La pieza de prueba presentaba cinco entradas y un diámetro de canal que oscilaba entre 1,5 y 12 mm. Primero, la pieza se imprimió con soporte soluble, que no se pudo eliminar de la pieza incluso después de múltiples intentos. Luego imprimimos el mismo parche usando soporte líquido, que se eliminó con éxito, y demostramos que el líquido podía fluir fácilmente a través de esta pieza desde la entrada hasta la salida. A pesar de que la segunda pieza de prueba presentaba canales de diámetro mínimo más grandes en comparación con la primera pieza de prueba y contenía múltiples entradas, el soporte soluble aún no se pudo eliminar de la segunda pieza de prueba. Este hallazgo sugiere que la geometría irregular, que incluye múltiples ramas, diámetros variables y pequeños radios de curvatura, influyó en nuestra incapacidad para eliminar el soporte soluble de los canales. En base a estas dos piezas de prueba, utilizamos el material de soporte líquido para imprimir el dispositivo portátil.

En resumen, descubrimos que tanto los materiales de soporte solubles como los líquidos pueden usarse para fabricar canales fluídicos utilizando la impresión 3D multimaterial. El soporte líquido se puede utilizar con éxito para imprimir canales con diámetros tan pequeños como 300 micras, pero da como resultado una rugosidad adicional de la superficie del canal. El soporte soluble tiene una mayor calidad de impresión, es más preciso y crea menos aspereza superficial que el soporte líquido, pero el soporte soluble no se pudo eliminar de los canales más pequeños en las piezas de prueba.

Visualizando los canales internos de Mushtari

La pieza final se imprimió con muchas entradas de 1,5 mm de diámetro en toda la red fluídica, que se utilizaron para eliminar cualquier material de soporte líquido restante y para llenar la pieza con líquido de prueba. Visualizamos los canales rellenando Mushtari (Fig. 6b). Además de los medios transparentes utilizados para las pruebas iniciales, Mushtari también se llenó con un líquido quimioluminiscente (Fig. 6c) para visualizar mejor la red de canales internos.

Una aguja de calibre 22 se introdujo a presión en las entradas, y después de llenar la pieza, las entradas se taparon con pequeños tapones que se imprimieron en 3D con los mismos materiales que el portátil para crear un sello hermético.

Si bien las pruebas preliminares revelaron que todos los canales en las cinco piezas estaban libres de soporte líquido, descubrimos que no podíamos hacer fluir manualmente el líquido de entrada a salida en la red fluídica completa. Mientras que en una sola pieza, pudimos hacer fluir el líquido inyectado 3.5 metros a través de una sección del canal con diámetros que variaban de 1.4 a 11 mm, y a medida que aumentaba la longitud del camino, la presión requerida para el llenado completo del canal se volvió insuperable, probablemente debido a la acumulación resistencia del diámetro variable del canal, la longitud del canal y la curvatura del canal. La información sobre estos parámetros es crítica para las geometrías futuras que pueden diseñarse para cultivar comunidades bacterianas durante períodos de tiempo prolongados y que pueden optimizarse estructuralmente mediante simulaciones de flujo de fluido durante el proceso de diseño inicial. Bajo tales condiciones de cultivo, el flujo será importante para el intercambio de nutrientes y el diámetro del canal puede verse influenciado por el crecimiento de biopelículas en las paredes del canal en función de su diámetro y curvatura. 20

FIG. 7. Imágenes ópticas representativas de secciones transversales de piezas de prueba que se imprimieron utilizando los tres métodos de material de soporte. Imágenes en color disponibles en línea en http://www.liebertpub.com/3dp

Aumentando Mushtari

La biología sintética es un campo interdisciplinario que aplica un enfoque de ingeniería a la biología.21 Como tal, alude a prácticas que permiten la ingeniería de moléculas, células y microorganismos para realizar tareas específicas.21 En este sentido, Mushtari fue diseñado para actuar como un entorno potencial de “host” para la cocultura de microorganismos modificados genéticamente que forman una “comunidad” sintética. Los biólogos sintéticos usan bacterias dispares para capitalizar las especialidades fisiológicas únicas y las capacidades evolucionadas de cada microbio. E. coli es posiblemente la bacteria modelo mejor estudiada22 y se ha modificado para producir productos útiles, que incluyen aromas, 2 colores, 3 y combustibles.4 Sin embargo, E. coli no es el más adecuado para todas las aplicaciones. Por ejemplo, B. subtilis, una bacteria modelo grampositiva popular que se encuentra en el suelo, puede secretar grandes cantidades de proteínas, por lo que es una opción atractiva para la producción de enzimas comerciales y productos biofarmacéuticos basados ​​en proteínas.23

La desviación media y estándar de cada diámetro por tipo de soporte se calcularon utilizando tres réplicas impresas y medidas para cada tipo de soporte. Los diámetros se midieron en la dirección de la orientación de la impresión. Normal, soluble y Liquid-H se imprimieron en el mismo orientación horizontal. Liquid-V se imprimió en orientación vertical.
FIG. 8. Visualización de la probeta utilizada a menor escala. La imagen de la izquierda muestra la forma real de la pieza impresa. La imagen del medio y la imagen de la derecha visualizan cómo se distribuye e imprime el material de soporte (azul) dentro del usable para lograr un canal hueco.

Mushtari fue diseñado para actuar como un posible entorno “anfitrión” para el cocultivo de microorganismos modificados genéticamente que forman una “comunidad” sintética. Los biólogos sintéticos utilizan bacterias dispares para capitalizar las especialidades fisiológicas únicas y las capacidades evolucionadas de cada microbio. E. coli es posiblemente la bacteria modelo mejor estudiada22 y se ha modificado para producir productos útiles, incluidos aromas, 2 colores, 3 y combustibles.4 Sin embargo, E. coli no es la más adecuada para todas las aplicaciones. Por ejemplo, B. subtilis, una bacteria modelo grampositiva popular que se encuentra en el suelo, puede secretar grandes cantidades de proteínas, lo que la convierte en una opción atractiva para la producción de enzimas comerciales y biofármacos a base de proteínas.23

Tanto E. coli como B. subtilis son heterótrofos, lo que significa que deben obtener su carbono orgánico del entorno externo. Por el contrario, los microbios fototróficos, incluidas las cianobacterias y las algas, pueden capturar la energía solar y utilizarla para fijar el dióxido de carbono. En la naturaleza, las comunidades microbianas son complejas mezclas de diferentes especies que aprovechan diferentes capacidades metabólicas, lo que permite una división eficiente del trabajo. Los biólogos sintéticos han comenzado a aprovechar esta organización creando nuevos sistemas que combinan ensamblajes tanto fototróficos como heterótrofos.24 Mushtari fue diseñado para proporcionar un entorno para tal consorcio.

FIG. 9. (a) Comparación de las tasas de crecimiento (duplicaciones por hora) de Escherichia coli y Bacillus subtilis en varios materiales de tubo. Las barras de error representan la desviación estándar entre al menos seis réplicas biológicas. Crecimiento representativo de E. coli (b, izquierda) y B. subtilis (b, derecha) en diferentes tubos. Las barras de error representan la desviación estándar entre tres réplicas biológicas cultivadas el mismo día. Imágenes en color disponibles en línea en http://www.liebertpub.com/3dp

Estudios de citotoxicidad

Dado que uno de los objetivos del dispositivo portátil impreso en 3D es albergar microorganismos dentro de los canales huecos, era necesario investigar la citotoxicidad de los materiales impresos en 3D. Para investigar la citotoxicidad potencial de las piezas impresas en 3D y su impacto en el crecimiento microbiano, se imprimieron tubos especializados para imitar el material de laboratorio de plástico utilizado en el cultivo microbiano estándar. Los tubos tenían una geometría similar a un tubo de cultivo de polipropileno estándar de 14 ml (Falcon; Corning), mientras que
Los tubos de cultivo impresos en 3D se diseñaron para ser más gruesos en un intento de minimizar las posibles fisuras y fugas. Antes de que las piezas impresas en 3D pudieran usarse para cultivar microbios, fueron pretratadas y esterilizadas. El pretratamiento consistió en eliminar los materiales de soporte con un chorro de agua (limpiador de agua a alta presión PowerBlast; Balco) seguido de inmersión en hidróxido de sodio al 2% durante 1 h. Siguió otra limpieza con el chorro de agua. Este proceso se repitió luego, de modo que las partes se expusieron dos veces a la solución de hidróxido de sodio. A continuación, las piezas impresas en 3D se hirvieron, se enjuagaron con agua destilada y luego se esterilizaron en autoclave. Se comprobó la esterilidad mediante la adición de medios ricos a los tubos después de la esterilización. Después de la incubación durante la noche a 37ºC, no se observó crecimiento bacteriano. Si bien muchos de los tubos impresos en 3D podrían usarse con éxito para el cultivo celular, otros demostraron no ser herméticos. Dado que esto se observó con mayor frecuencia en piezas esterilizadas que en piezas de prueba sin tratar, los estudios futuros se centrarán en optimizar los protocolos de tratamiento y esterilización para disminuir la dureza y, en consecuencia, limitar las fugas.

Para los estudios de crecimiento microbiano, se utilizaron dos especies bacterianas modelo, E. coli y B. subtilis. Se extrajeron E. coli (BW25113) y B. subtilis (168, ATCC # 23857) de las reservas congeladas en placas de caldo Luria (LB). Se seleccionaron colonias individuales para obtener réplicas biológicas y se cultivaron en LB líquido. Después del crecimiento durante la noche o hasta un estado visualmente turbio a 37ºC, los cultivos se diluyeron hasta una DO600 baja (* 0,05) medida por cubeta en LB líquido fresco. A continuación, estos cultivos se dividieron en tres condiciones: (1) tubos de polipropileno como controles; (2) Tubos VeroClear con material de soporte insoluble (SUP705); y (3) tubos VeroClear con material de soporte soluble (SUP707) (Fig. 9a). Cada tubo de cultivo sin tapar se colocó dentro de un tubo de polipropileno de 50 ml (Falcon; Corning), que luego se tapó. Para preparar los controles negativos, se agregaron 5 mL de medio LB a tres tubos VeroClear, impresos con material de soporte insoluble o soluble, y tres tubos de polipropileno. Estos tubos también se colocaron dentro de tubos de polipropileno BD Falcon de 50 ml. Todos los tubos se cultivaron en una incubadora a 37ºC agitando a 200 rpm. Las mediciones se tomaron cada 30 minutos hasta que las células parecieron alcanzar un crecimiento estacionario. Las mediciones de DO600 se tomaron usando un lector de placas de 96 pocillos. Se restaron las lecturas de los medios en blanco y estos valores se informan directamente en los datos representativos que se muestran en la Figura 9b, c. Para calcular el tiempo de duplicación, se calculó la base logarítmica dos de cada muestra. La serie de tiempo para cada réplica se representó con log2 (valor de DO600) frente a horas. Para cada condición, se determinó una línea de mejor ajuste para cada período de 1,5 h. Se informa la tasa de crecimiento máxima con un valor de R2 superior o igual a 0,96. Para cuantificar la variación entre las muestras biológicas para cada condición, luego medimos las duplicaciones por hora para cada muestra biológica y calculamos la desviación estándar. No encontramos diferencias estadísticamente significativas en las tasas de crecimiento de E. coli o B. subtilis en los tubos impresos en 3D (con cualquiera de las condiciones de soporte) en comparación con los tubos Falcon de control estándar. Estos resultados demuestran que los organismos modelo microbianos E. coli y B. subtilis pueden cultivarse dentro de los recipientes impresos en 3D sin efectos de crecimiento negativos medibles. El trabajo futuro explorará la biocompatibilidad de estos materiales para el cultivo de otros microbios heterótrofos y autótrofos diseñados para agregar funcionalidad a los consorcios en sistemas fluídicos complejos.

Los campos de la biología sintética y la impresión 3D se están desarrollando rápidamente, pero de forma independiente entre sí. Mushtari, el wearable y su conjunto asociado de herramientas, técnicas y tecnologías, demuestra y apunta hacia las posibilidades de diseño que se encuentran en la intersección de estos campos, así como la relevancia de dicha intersección para las aplicaciones en el diseño de productos. Diseñamos un wearable fluido con el objetivo final de mediar en la funcionalidad de las comunidades microbianas mediante la “creación de plantillas” de los entornos que los contienen mediante la impresión 3D multimaterial. Como tal, la investigación experimental presentada en este documento muestra el primer dispositivo portátil fluídico de su tipo que demuestra el crecimiento computacional de canales fluídicos multimateriales imprimibles en 3D a escala de producto.

El proyecto logró tres objetivos, relevantes para tres dominios de investigación, a saber: diseño computacional, fabricación aditiva y biología sintética. Entre ellas se incluyen las siguientes: (1) desarrollo e implementación de un enfoque computacional para generar fluídica a escala de producto y modelado heterogéneo de propiedades de materiales para plantillas funcionales; (2) implementación, caracterización y evaluación de formulaciones de materiales de soporte para la creación de fluidos a escala de producto; y (3) evaluaciones de citotoxicidad de materiales fotopoliméricos impresos en 3D con especies microbianas modelo.

El diseño actual de Mushtari incorpora emocionantes desafíos de investigación que se encuentran en la intersección de la fabricación aditiva y la biología sintética. Estos incluyen (1) desafíos asociados con la carga del dispositivo portátil, es decir, cargar los medios requeridos (células o tejidos) dentro y fuera del producto; (2) desafíos asociados con el mantenimiento de células y cultivos sanos y vivos (por ejemplo, esterilidad, intercambio de gases y biocompatibilidad para otras especies microbianas); y (3) desafíos asociados con la extracción de cualquier “producto” (por ejemplo, azúcar, fragancia o biocombustible) que haya sido generado por los microbios contenidos en el dispositivo portátil.

En este artículo, demostramos que al usar las impresoras 3D multimaterial disponibles actualmente, es posible controlar la deposición de múltiples materiales a la resolución nativa de la impresora. En el contexto de Mushtari, nos centramos en el control de la opacidad del material y la contención de fluidos. La integración de materiales flexibles en el proceso de diseño nos permitiría también controlar el módulo elástico, lo que, a su vez, podría abrir muchas nuevas posibilidades de diseño. Dichas oportunidades pueden incluir pieles para vestir que no solo contengan medios biológicos, sino que también puedan filtrar dichos medios de manera selectiva. Dado que las modernas impresoras 3D multimaterial18 pueden imprimir en aprox. Resolución de vóxeles de 32 lm, señalamos la posibilidad de que el aumento de la resolución de los sistemas de impresión 3D permitiría la creación de membranas y poros selectivamente permeables. Esto podría permitir la producción de un sistema de transporte y filtración más sofisticado y regulado dentro del dispositivo portátil, que intercambia e interactúa con el usuario. Además, los compuestos terapéuticos creados dentro del sistema fluídico podrían almacenarse en áreas específicas y administrarse localmente a la piel. Finalmente, al combinar estrategias avanzadas de diseño computacional para el crecimiento digital con impresión 3D multimaterial en alta resolución espacial como se muestra aquí, Mushtari allana el camino hacia objetos multifuncionales con variación de propiedades espacio-temporales en alta resolución. Los sistemas de un solo material como Mushtari permitirán, en el futuro, el diseño y la producción de wearables “respirables” y “vivos” que pueden interactuar con nuestros cuerpos y nuestro entorno, formando una verdadera ecología material a través de escalas.

Expresiones de gratitud

Los autores agradecen a Naomi Kaempfer, directora de arte, moda y diseño de Stratasys, ya los miembros del equipo relacionados, Tal Ely y Yoav Bressler, por su conocimiento y dedicación en la producción de Mushtari. El apoyo de la empresa ha permitido el uso de la impresora 3D multimaterial Objet500 Connex3. Los autores agradecen a David Kong y Lincoln Lab (el ID del premio del patrocinador es 7000345090) por sus conocimientos recientes inspirados en Mushtari: su diseño y producción. Los autores también agradecen a Yoram Reshef por sus fotografías del diseño final, así como a Paula Aguilera y Jonathan Williams por su apoyo en materiales visuales adicionales. Esta investigación fue apoyada, en parte, por el Premio de la Fundación Nacional de Ciencias DGE1144152, Departamento de Energía DE-SC0012658 “Biología de Sistemas de Simbiontes Autótrofos-Heterótrofos para Bioenergía”, SynBERC, y el Instituto Wyss de Ingeniería de Inspiración Biológica.

Declaración de divulgación del autor

No existen intereses financieros en competencia.

Referencias

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Autores

Christoph Bader, 1, * William G. Patrick, 1, * Dominik Kolb, 1 Stephanie G. Hays, 2,3 Steven Keating, 1 Sunanda Sharma, 1 Daniel Dikovsky, 4 Boris Belocon, 4 James C. Weaver, 3 Pamela A. Silver, 2,3 y Neri Oxman1
1
MIT Media Laboratory, Escuela de Arquitectura y Planificación, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, Massachusetts.
2
Departamento de Biología de Sistemas, Harvard Medical School, Boston, Massachusetts.
3
Instituto Wyss de Ingeniería Biológicamente Inspirada, Universidad de Harvard, Cambridge, Massachusetts.
4
Stratasys, LTD., Rehovot, Israel. *Cofirst autores.

Traducción YVR

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